2020《中国药典》新增通用技术要求-X射线荧光光谱法药物分析的应用

       药物安全与国计民生息息相关，世界各国都越来越重视药物质量安全。2010年国际人用药品注册技术协调会(ICH)发布了Q3D元素杂质指导原则，ICH*Q3D准则规定了24种有毒元素每天摄入的限制量，并要求对这些元素进行高灵敏度、高精度测量。美国、欧盟也进一步限制了药品中的元素杂质水平，药品中元素杂质的控制越来越受到关注。

       各种化学和仪器分析方法在解决药品研发和质量控制中发挥着重要作用。目前常用于药品质量控制和评价的分析技术主要包括：化学法、色谱法、光谱法、电化学法、电泳法、流动注射和顺序注射分析以及联用技术等。X射线荧光光谱分析法(X-rayFluorescenceSpectrometry，XRF)是元素成份分析中最为有效的方法之一，此方法测试元素范围广，可测定原子序数5B-92U（Be）的所有元素，并可多元素同时测定，是一种快速且精密度高的分析方法，广泛应用于冶炼、地矿、农业、环保、医药、考古、工业制造和司法鉴定等众多领域。x射线荧光光谱具有快速、无损、前处理简单、分析精度高、分析范围广、稳定性好等优点。在药品检测方面，XRFS多用于药品的元素成分分析以及鉴定评价和质量控制。

一、Ｘ射线荧光光谱法（XRFS）在药物检测标准中的现状

      《美国药典》〔USP〕41版通则〈735〉、《欧洲药典》〔EP〕9.0版通则〈2.2.37〉和《英国药典》〔BP〕2019版〈附录ⅡK〉均收载了XRF技术。USP介绍了XRF的定义、仪器原理、仪器性能、测定方法、确认和验证等内容。EP介绍了XRF的定义、原理、测定方法、校正方法及计算公式。BP介绍了XRF的原理、仪器、基体效应和干扰、样品制备、测定方法、仪器性能控制和验证要求。BP还指出XRF作为质量控制或过程控制方法，广泛用于筛选原料药和制剂中的元素杂质。由于XRF的非破坏性，适用于过程分析技术（PAT），如分析原料药中残留的痕量催化剂。
       2020年版中国药典（四部）新增通用技术名单包含〈0461X射线荧光光谱法〉，P57。

       标志着我国药物杂质元素分析上迈出了重要一步，有效补充了现有分析手段，特别是在快速筛选和质量控制上。

二、X射线荧光光谱仪（XRF）的原理、分类和特点

       X射线荧光光谱（XRF）法是利用初级X射线光子激发待测物质中的原子内层电子，使之产生特征X射线荧光（次级X射线），通过精确测量荧光的能量或波长，根据波长与元素序数间的关系以及荧光强度与含量的正比关系，对被测样品中的元素进行定性、定量分析的方法。
       XRF具有分析速度快、分析元素范围广、前处理简单、污染小、成本低以及无损等优点，可用于各类样品中主、次、痕量多元素同时测定。根据分光方式及光路的不，XRF可分为波长色散型WDXRF、能量色散型EDXRF、全反射型（TXRF）等。WDXRF分辨率高、检出限低，体积大，需要较强的光源和专用的晶体光学元件，价格高。EDXRF不使用分光晶体，光路相对简单，光源功率也相对较小，价格低。自20世纪60年代早期开始逐渐商品化，随着硬件和软件的不断发展，逐渐成本元素成份分析的主要手段之一。目前同时配备XRF、ICP、ICP-MS是国内外分析实验室的趋势，利用XRF分析含量较高的元素，用电感耦合等离子体质谱ICP-MS分析低浓度的元素。

三、XRF在药物元素分析中的应用

1、在药物研发中的应用

       制药企业通常将新药研究重点聚焦于未满足的医疗需求上，新药的研发速度往往由患者驱动。因此药物研发过程中快速做出决策，可更快地提高患者的治愈率，元素杂质分析是提高研发效率的一个重要步骤。金属催化剂通常用于原料药的合成中，研发者需要监测各种原料和合成工艺中金属催化剂的残留情况，从而实施有效的控制策略。通常使用灵敏度高、精密度高和选择性好的电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES或ICP-MS）对药物中的元素杂质进行分析。然而在药物研发期间许多样品不需要这些昂贵、费时、灵敏度高的技术。研发者通常需要快速确定元素含量，以提高优化合成工艺的效率。XRF可更快速、更便捷地测定原料、中间体和研发样品中的元素杂质含量，同时保证必要的准确度。XRF可替代传统的ICP-OES测定金属杂质含量，快速确定金属催化剂去除工艺的有效性，可为原子光谱和工艺化学部门节省近两个月的全职人力工时，同时节省溶剂、氩气和耗材等使用费用。

2、在原料药元素杂质分析中的应用

       作为提高药物安全性和有效性的一部分，制药企业和监管机构对原料药（API）的杂质控制十分重视。元素杂质可以从各种来源（如原料、试剂、溶剂、催化剂、反应容器、管道和其他用于合成药物的设备）引入原料药中。由于某些元素具有潜在的毒性，美国FDA指南指出，在制药生产中控制残留元素含量至关重要。MarguE等利用WDXRF测定原料药中的金属杂质铁、锌、铬、镍方法的检出限和定量限满足欧洲药品评价局（EMA）和ICHQ2（R1）的要求，适用于原料药目标无机杂质的定性和定量检测。与药典的重金属目视比色检测方法不同，该技术可以轻松实现自动化，是快速常规分析的理想工具。催化在医药化学工业中具有重要的作用，它可以减少碳-碳和碳杂原子键形成过程中的活化能，从而提高结构改造的效率，降低总成本和时间。钯通常被认为是原料药形成碳-碳和碳杂原子键应用最广泛的金属，在医药工业中广泛用于催化反应，但必须将其除去后方可成为药用原料。MarguE等通过X射线荧光光谱仪建立了一种简单、快速、可靠的分析方法，可测定三唑类抗真菌原料药中催化剂靶的残留量。
        EDXRF类型中的TXRF比传统EDXRF的背景信号更低且检测限低3个数量级，还具有动态范围宽（至少4个数量级）、所需样品量小（ug）、定量简单、基体效应可忽略等优点，可通过内标实现对原子序数在14~92内的多元素快速定量测定，是一种快速的元素筛选分析技术。WagnerM等利用TXRF研究了不同来源的胰岛素、普鲁卡因和色氨酸样品中的微量元素的含量比例，得到了元素指纹图谱相关信息，能够区分不同生产纯化工艺的不同批次的样品。LsztityA等利用TXRF筛查发现，左旋多巴中金属含量低于5ug/g，亚叶酸钙中铁、锌、锶的含量分别为为44、10、6ug/g，马来酸依那普利中铁的含量为17ug/g，AntoszFJ等利用TXRF对原料药样品中的钯和铜进行了定量分析，测定结果在检出限、定量限、准确度和精密度方面与ICP-MS相当。

3、在药用辅料元素杂质分析中的应用

       2015版《中国药典》采用原子吸收光谱法（AAS）测定明胶空心胶囊中的有毒重金属铬的残留，该法需要复杂的前处理过程，时间消耗较长。李俊卿、尹利辉等建立了EDXRF快速检测明胶空心胶囊中铬的含量。方法的检测限为10mg/Kg，与AAS测试结果比较，Cr含量大于10mg/Kg的阳性样品的检测率为100%。该方法可以无损伤直接测试样品，一次同时分析多种元素，分析时间，4分钟即可筛查出一个样品，大大提高了分析效率。

4、在制剂元素杂质分析中的应用

       对患者而言，药物制剂的安全性和有效性更为重要。因此袁重点研究XRF在制剂元素杂质分析中的应用比工艺研发时分析个别原料药的元素杂质残留量更有意义。GoncalvesLML利用WDXRF对两种原研药和仿制药中的金属元素杂质含量进行了测定，结果显示WDXRF在一定范围内具有可接受的线性、精密度和准确度，适用于药物制剂中铜、锌、铁、铬杂质的测定，是药典中重金属目视比色检测法、AAS、ICP的良好替代方法。
       由于制样简单、设备和分析成本较低，以及可对大量样品进行快速筛查，XRF已被美国FDA用于各种监管用途。

四、2020《中国药典》〔四部〕〈0461X射线荧光光谱仪〉通用技术要求

        X射线荧光光谱法(XRF)是一种基于测量由初级X射线激发的原子内层电子产生特征次级x射线的分析方法。XRF可用于液体、粉末及固体材料的定性、定量分析。XRF仪可分为波长色散型(WDXRF)和能量色散型(EDXRF)。
       当X射线照射到供试品时，供试品中的各元素被激发而辐射出各自的荧光x射线。通过准直器经分光晶体分光，按照布拉格定律产生衍射，使不同波长的荧光x射线按照波长顺序排列成光谱，不同波长的谱线由探测器在不同的衍射角上接收。根据测得谱线的波长识别元素种类;根据元素特征谱线的强度与元素含量间的关系，计算获得供试品中每种元素含量百分数，即为X射线荧光光谱分析法。

供试品的制备
       液体供试品可以直接进样分析，固体供试品可以直接压片或与适当的辅剂混合处理后压片进样分析。

仪器的校正和检定
       仪器使用前应使用国家标准物质或其他可溯源的标准物质校正。

测定法
       X射线荧光光谱法中一般应选择强度大、干扰少、背景低的特征谱线作为分析线。

定性分析
       根据每种元素特征x射线荧光谱线可对供试品中所含元素种类进行定性分析。

定量测定法
(1) 标准曲线法
       液体样品采用元素不同浓度的对照品或者采用元素分级稀释法制备不同浓度的对照品供检测分析用，固体样品采用不同含量的对照品或者采用标准加人法制备不同含量的对照品供检测分析用。对照品应与供试品的化学组成和物理性质等方面一致。分别测定系列对照品的X射线强度，以待测元素的浓度(含量)为横坐标，以X射线强度为纵坐标，建立标准曲线。标准曲线应在测定前或定期进行校准。

(2) 内标法
      将相同量的内标元素分别加人到待测元素已知并且元素浓度(含量)呈梯度的一-组样品中制成系列对照样品。在选定的分析条件下分别测量对照品中待测元素与内标元素的X射线强度，计算待测元素与内标元素的X射线强度比，以该强度比为纵坐标，待测元素浓度(含量)为横坐标建立标准曲线。
      在待测样品中也加入相同量的同一种内标元素，制成供试品，同法测量并求得X射线强度比，由标准曲线获得待测元素的浓度(含量)。

(3) 标准加入法
       取相同量供试品(或相同体积供试品溶液)6份，除第一份外，在其他几份中，分别精密加入不同量的待测元素对照品(或对照品溶液)，制成系列待测样品;在选定的分析条件下分别测定，以待测元素X射线强度为纵坐标，待测元素加入量为横坐标，绘制标准曲线，将标准曲线延长交于横坐标，由交点与原点的距离求算供试品中待测元素的浓度(含量)。此法要求待测元素的浓度(含量)与X射线强度呈线性关系。

(4) 数学校正法
       数学校正法中的经验系数法、经验系数与基本参数联用法等，用于各种不同分析对象时，可有效地计算和校正由于基体的吸收和增强效应对分析结果的影响，对于谱线干扰和计数死时间，也可以得到有效的校正。

理学X射线荧光光谱仪助力药物中金属元素成份分析

WDXRF/TXRF

五、小结

       XRF法具有快速、准确、非破坏性等优点，分析元素覆盖面广（包括铍～铀），分析浓度范围宽（0.0001％～100％），分析样品可以是固体或液体。而随着科技的不断发展多种分析方法和技术的联用将是未来的发展方向，XRF法的应用范围也将不断扩大。
       可作为AAS、ICP-AES和ICP-MS等元素分析技术的有效补充，可定量、定性分析原药、辅料、制剂、包材中的残留元素。
       目前USP、EP、BP、《中国药典》均已收载XRF作为法定的一般检测方法，有利于规范和指导XRF在药品质量控制中的应用，药品中元素杂质的检测又增加一种有效的质量控制方法。

参考文献：
[1]刘奕忍,李琴梅,袁赵婷等，.X射线荧光光谱技术在药品检测中的应用.分析仪器2018.218(3)35-7.
[2]孙琳,梁鹏晨,严铸云等.六种钙类矿物药元素谱的X射线荧光光谱法无标样分析.中国实验方剂学杂志2018.24(9)70-6.
[3]罗立强,詹秀春,李国会.X射线荧光光谱分析北京院化学工业出版社
[4]李俊卿,尹利辉,张锐等.X射线荧光元素分析技术在胶囊、明胶及阿胶铬快速检查中的应用.中国药师2013.16(2)215-7.
[5]USP(41)VolI[S].2018.6486-6491.
[6]EP(9.0)VolI[S].2016.61.
[7]BP(2019)VolV[S].2019.V-A198-V-A199.
[8]2020《中国药典》〔四部〕〈0461X射线荧光光谱法〉